Fluorimetrie

Antwort D ist korrekt.

Fluoreszierende Stoffe sind in der Regel starre planare Moleküle mit aromatischen Elementen. Auch konjugierte Doppelbindungen, Carbonylverbindungen und kondensierte Heterocyclen sind häufige Strukturelemente, allerdings muss eine größere Anzahl an π-Bindungen vorliegen, damit fluoreszierende Eigenschaften entstehen. ^{1 2} Abbildungen: ^{3 4 5 6}.

Antwort C ist korrekt.

Die Formel für die Intensität der Fluoreszenz lautet: ⚠ $ I_F = \phi_F \cdot I_0 \cdot \epsilon \cdot c \cdot b $ , somit ist sie proportional zu allen Faktoren und unter den Genannten treffen somit 1 und 3 zu. Dabei ist ⚠ $\phi_F$ die Quantenausbeute, ⚠ $\ I_0$ die Intensität des Anregungslichtes, ⚠ $ \epsilon $ der molare Extinktionskoeffizient, ⚠ $c$ die Konzentration und ⚠ $b$ die Schichtdicke der Küvette. ⁷.

Antwort B ist korrekt.

Da die emittierten Photonen der Fluoreszenz gemessen werden, können Photodiodenarray und Photomultiplier eingesetzt werden. Das Massenspektrometer und der Flammenionisationsdetektor würden beide vorraussetzen, dass es sich um Atome handelt. Licht besitzt weder Masse, noch ist es ionisierbar.

^{8 9}

Antwort E ist korrekt.

Die Konzentration lässt sich nach folgender Formel berechnen: ⚠ $ \ c_{P} = \frac{c_{S}}{\frac{I_{F,Add}-B_{Add}}{I_{F,P}-B_{P}}-1} $

Berechnung des Faktors: ⚠ $\ f=\frac{µg}{10 ml}\cdot\frac{100 ml}{µg} = 10 $

⚠ $ \ c_{P} = \frac{1,2}{\frac{39,837-0,140}{23,749-0,071}-1}\cdot 10 = 17,7 [µg/100 ml] $ . ¹⁰

Antwort B ist korrekt.

Beim Übergang vom Singulett- in den Triplett-Zustand (intersystem crossing) wird Energie durch strahlungslose Spin-Umkehr abgegeben, weshalb eine geringere Energie bei der Inaktivierung emittiert und die Wellenlänge größer wird.

Bei der Fluoreszenz kommt es, im Gegensatz zu Phosphoreszenz, nicht zu einem solchen Übergang, weshalb die Phophoreszenz bei einer größere Wellenlänge emittiert. Dies kann auch dem Jablonski-Termschema entnommen werden.

^{11 12}

¹³

Die Lichtquelle emittiert Anregungslicht (Xenon- oder Quecksilberlampe). Der Anregungsmonochromator sorgt dafür, dass nur bestimmte Wellenlängen die Probe bestrahlen (am besten Wellenlängen in welchen der Analyt besonders gute Absorption aufweist). Die Probe wird angeregt und emittiert Licht (fluoresziert) in alle Richtungen. Im 90 Grad Winkel zur Probe steht der Emissionsmonochromator, welcher Streulicht eliminiert und somit nur bestimmte Wellenlängen zum Emissionsdetektor passieren lässt, der am Ende die emittierten Wellenlängen und die Intensität der Fluoreszenz vermisst. Wenn (optional) noch ein Absorptionsspektrum aufgenommen werden soll, blockiert der Monochromator hier die durch Fluoreszenz emittierten Wellenlängen und lässt somit nur das erwünschte Licht zum Absorptionsdetektor passieren. ^{14 15 16}

1. Bei der UV/VIS-Spektroskopie wird die Absorption betrachtet. Eine Probe wird mit monochromatischem Licht bestrahlt und die Absorption (welche sich ermitteln lässt aus der Intensität des Lichts bei Ein- und Ausgang) wird detektiert. Bei der Fluorimetrie ist die Absorption nur ein Teil des Vorgangs, entscheidend ist die Anregung des Moleküls und die bei der Rückkehr in den Grundzustand emittierte Fluoreszenz. ^{17 18}

2. Mit der UV/VIS-Spektroskopie ist es möglich aufgrund von der Absorption auf die funktionellen Gruppen im Molekül zu schließen, bei der Fluorimetrie nicht. Die emittierten Wellenlängen sind unspezifisch für funktionelle Gruppen und geben somit leider keinen Rückschluss. Deshalb wird Fluorimetrie, im Gegensatz zur UV/VIS- Spektroskopie hauptsächlich zur Quantifizierung eingesetzt. ^{19 20}

3. Fluorimetrie hat eine bessere Nachweisempfindlichkeit im Vergleich zur UV/VIS-Spektroskopie. Bei der Fluorimetrie ist diese Grenze zwar ebenfalls abhängig von Faktoren wie dem Detektor oder der Probe, jedoch sind fluoreszierende Verbindungen um bis zu 3 Größenordnungen besser nachweisbar. ^{21 22}

Aufgrund dessen, dass die Intensität des anregenden Lichts proportional zur Intensität des emittierten Lichts ist, würde eine Schwankung bei der Bestimmung/ über mehrere Messungen (Standardadditionsverfahren) einen unbekannten Faktor darstellen, welcher die Messgenauigkeit beeinflusst. ^{23 24}

Die Xenonlampe ist ein Kontinuumstrahler, bedeutet er ist weniger intensiv, deckt jedoch ein relativ breites Spektrum an Wellenlängen ab. Bei der Quecksilberlampe ist das umgekehrt, hier ist die Intensität des Lichts stärker, jedoch ist dafür das Spektrum an möglichen Wellenlängen kleiner. Der Vorteil der höheren Intensität des Anregungslichts ist, dass somit auch die Nachweisgrenze gesenkt werden kann, da die Probe somit auch stärker emittiert. Der Vorteil eines breiten Spektrum ist, dass verschiedene Stoffe ihr Absorptionsoptimum an verschiedenen Wellenlängen haben und man somit auch ein breites Spektrum benötigt, um viele verschiedene Stoffe zu vermessen. Deshalb werden um diese beiden Eigenschaften zu kombinieren auch gerne Mischungen der Lampen verwendet (Stichwort: Quecksilber-Xenonlampen). Eine Bestimmung mit Lasern ist möglich, Vorteil ist die starke Intensität des Lasers. Der große Nachteil einer Bestimmung mit einem Laser ist, dass die Wellenlänge sehr spezifisch ist, weshalb die Verwendung eher selten ist. ^{25 26}

Bei dem Standardadditionsverfahren werden verschiedene Fluoreszenzintensitäten bei unterschiedlichen linear steigenden Konzentrationen gemessen, um mit Hilfe einer Kalibriergerade auf die Konzentration der Probe schließen zu können. Hierfür wird der Probelösung ein Standard mit bekannter Konzentration in linear steigenden Volumina hinzugefügt und die so entstehenden Lösungen einzeln vermessen. Der Schnittpunkt der Kalibriergeraden mit der x-Achse wird anschließend an der y-Achse achsengespiegelt, um im positiven Achsenbereich die Konzentration der Probelösung ablesen zu können. ^{27 28}

Protonierung und Deprotonierung können einen großen Einfluss auf die Fähigkeit eines Molekül haben, Energie in Form von Fluoreszenz abzugeben. Wichtig ist hier die Veränderung des delokalisierten π-Elektronensystems, das wichtig für die Absorption der Strahlung ist. Eine Vergrößerung des π-Elektronensystems führt zu einer bathochromen Verschiebung der Absorption (in größere Wellenlängenbereiche), eine Verkleinerung zu einer hypsochromen Verschiebung (in kleinere Wellenlängenbereiche). Beim Riboflavin reichen diese Verschiebungen zur Fluoreszenzauslöschung und es kommt zu einer strahlungslosen Inaktivierung. ^{29 30 31}

Die Fluorimetrie wird nur selten zur qualitativen Bestimmung eingesetzt, da es häufig keinen Zusammenhang zwischen dem Spektrum und der chemischen Struktur gibt. Außerdem haben Geräteparameter häufig einen sehr großen Einfluss auf die Ergebnisse. Bei unbekannten Proben kommt es zu weiteren Schwierigkeiten beim Arbeiten mit Referenzspektren: Bei gleichen Chromophoren und unterschiedlichen Alkylsubstituenten sind die Spektren sehr ähnlich, was die Identifikation stark erschwert. ^{32 33 34}

Die unterschiedlichen Lumineszenzen lassen sich durch ihre Anregung unterscheiden. Bei der Chemolumineszenz wird elektromagnetische Strahlung durch exotherme chemische Reaktionen emittiert. Die Biolumineszenz ist eine Art der Chemolumineszenz, bei der die Reaktion durch Enzyme in biologischen Systemen katalysiert wird. Anregung durch /alpha - und /beta - Strahlung, sowie anderen hochmagnetischen Partikeln hat eine Radiolumineszenz zur Folge. Bei der Thermolumineszenz erfolgt die Emission durch eine Temperaturerhöhung. Eine Anregung durch Photonen bezeichnet man als Photolumineszenz, zu der auch Fluoreszenz gehört. ^{35 36}