UV 2

Titelblatt

Expertengruppe 08
Elena Torbica
Celine Thomalla
Julia Sommerfeld

Identitätsprüfung von Pyridoxin (UV2)

In diesem Versuch wird mit der Identitätsprüfung von Pyridoxinhydrochlorid untersucht, wie sich die Änderung des pH-Werts auf die Absorption eines Moleküls (Pyridoxin) auswirkt und ob es zu einer Verschiebung der Absorptionsmaxima kommt.

Inhaltsverzeichnis

Einleitung

Im Versuch UV2 geht es um die Identitätsprüfung von Pyridoxinhydrochlorid (Vitamin B6), wobei zusätzlich der Einfluss des pH-Werts auf die Absorption des Moleküls untersucht wird. Mit der UV/VIS-Spektroskopie wird die Lichtabsorption nach der Anregung von π- oder n-Elektronen mit ultraviolettem (UV) Licht im Bereich von 200nm bis 400nm oder sichtbarem Licht (VIS) von 400 bis 800nm gemessen, der Artikel UV-VIS-Spektroskopie liefert die Grundlagen der optischen Methode. Im Ring des Heteroaromaten von Pyridoxin befindet sich ein delokalisiertes π-Elektronensystem, das bei verschiedenen pH-Werten (vgl. Abb. 1) unterschiedlich verstärkt wird und eine hypsochrome Linksverschiebung oder eine bathochrome Rechtsverschiebung im Absorptionsmaximum verursachen können. Dieser Effekt wird in dem Versuch untersucht. ²

Versuchsbeschreibung

Ziel des Praktikumsversuchs ist es, mithilfe der UV/VIS-Spektroskopie herauszufinden, ob die zu überprüfende Substanz den Anforderungen des Arzneibuchs entspricht. Dafür wird aus den ermittelten Absorptionen zunächst der molare Absorptionskoeffizient (ε) und daraufhin die spezifische Absorption (A1%,1cm) in 100ml/g⋅cm bei den für das Pyridoxin-Hydrochlorid charakteristischen Wellenlängen berechnet.

Exkurs Pyridoxin

Pyridoxin gehört mit Pyridoxal und Pyridoxamin zum Vitamin B6. Dieses lässt sich in allen lebenden Zellen finden, besonders aber in Hefe, Körnerfrüchten, grünem Gemüse, Eigelb und Milch, in Leber, Niere und Gehirn. Es wird als Nahrungsergänzungsmittel eingesetzt, wobei ein Mangel eher selten vorkommt. Die mittlere, tägliche Dosis eines Erwachsenen liegt bei 1,6 mg. Als Folgen einer Mangelerscheinung treten Neuritiden (Nervenentzündungen), epileptische Krämpfe, hypochrome Anämien und seborrhoische Krämpfe (gelbliche und fettige Schuppen, besonders im Gesicht und am Kopf) auf ³. Solche Symptomatiken lassen sich beispielsweise vermehrt bei Alkoholikern wiederfinden.⁴

Verhalten von Pyridoxin im sauren und im basischen Milieu

Die Absorption nach Bestrahlung mit unterschiedlichen Wellenlängen ist für jedes Molekül charakteristisch und jeweils abhängig von verschiedenen Bedingungen. So haben die Art des Lösungsmittels, die Wahl der Küvette sowie der pH-Wert einen Einfluss auf die Absorption. Wenn das Pyridoxin im Sauren vorliegt, wird die Amino-Gruppe am Heteroaromaten protoniert, was eine Verringerung der Delokalisation der π-Elektronen (-M-Effekt) zur Folge hat. Das Absorptionsmaximum liegt hier bei 290nm. Liegt das Molekül nun im Basischen vor, wird die Hydroxy-Gruppe am Heteroaromat deprotoniert und es kommt zur Bildung eines Phenolats. Diese zusätzliche negative Ladung hat eine erhöhte Delokalisation der π-Elektronen (+M-Effekt) zur Folge, was wiederum eine Änderung des Absorptionsmaximums mit sich bringt. Es kommt hier beim Übergang vom Sauren ins Basische zu einer bathochromen Verschiebung, also einer Verschiebung in den langwelligeren Wellenlängenbereich (siehe Abb. 2). Die Absorptionsmaxima liegen hier bei 309 und 244 nm. In einem neutralen Milieu liegt das Molekül sowohl im Ungeladenen, als auch im zwittrigen Zustand vor, es herrscht ein Gleichgewicht zwischen den Zuständen. Der -M-Effekt der Amino-Gruppe und der +M-Effekt des Phenolats liegen zusammen vor, was zu einem sogenannten push-pull-Effekt führt. Als Folge hat man hier eine besonders gute Delokalisation der π-Elektronen, weshalb die Molekülorbitale näher beieinander liegen und weniger Energie benötigt wird, um die Elektronen des Moleküls anzuregen (siehe Abb. 1). ⁶

Instrumenteller Aufbau

Ein UV-VIS-Spektrometer besteht in der Regel aus vier Hauptelementen: einer Strahlungsquelle, einem Monochromator, einem Probenraum und einem Detektor. Je nach Art des Photometers können sich diese Komponenten unterscheiden. Die Aufzeichnung der Messdaten erfolgt elektronisch mithilfe eine Software, die ebenfalls Teil des instrumentellen Aufbaus ist (Elektronische Datenverarbeitung, EDV).

In dem Praktikumsversuch wird ein Einstrahlphotometer verwendet (SPECORD® 40, siehe Abb. 3 und 4). Das bedeutet, dass nur eine Probenkammer zum Vermessen zur Verfügung steht und somit Proben und Referenzsubstanzen jeweils nacheinander vermessen werden müssen. Bei Zweistrahlphotometern hingegen werden Probe und Referenz gleichzeitig eingesetzt und immer abwechselnd vermessen.

Die Strahlungsquelle kann ebenfalls variieren. Um den gesamten UV-VIS-Bereich ohne Wechsel der Lampen abdecken zu können, eignet sich eine Xenonlampe. Ihr Nachteil ist jedoch ein recht hohes Flackern. In diesem Fall wird deshalb eine Kombination aus einer Deuteriumlampe für den UV- und einer Halogenlampe für den VIS-Bereich verwendet.⁸ Insgesamt decken die verwendeten Strahlungsquellen gemeinsam einen Wellenlängenbereich von 190 bis 1100nm ab.

Als Monochromator wird meist entweder ein Prisma oder ein Gitter eingesetzt, an dem die Lichtstrahlen jeweils gebrochen beziehumgsweise gebeugt werden. Beide verfügen über einen Ausgangsspalt, mithilfe dessen sich die Bandbreite der durchgelassenen Wellenlängen einstellen lässt. Im Praktikum arbeitet man mit einem Photometer, das ein Gitter als Monochromator besitzt. Dieses funktioniert wie folgt: Das eingestrahlte Licht dringt zunächst durch den Eingangsspalt des Monochromators ein. Hier trifft es auf einen Konkavspiegel, der das Licht reflektiert, wodurch es auf das Gitter trifft. Am Gitter wird das Lichtspektrum aufgefächert und trifft auf einen zweiten Spiegel, der das Licht in Richtung des Ausgangsspalts reflektiert. Hier tritt nur das Licht der jeweils gewünschten Wellenlänge(n) aus. Gitter haben gegenüber Prismen den grundsätzlichen Vorteil, keine Eigenabsorption aufzuweisen.⁹

Der Probenraum besteht bei dem SPECORD® 40 wie bereits beschrieben aus einer einzelnen Probenkammer, in die Referenzen und Proben jeweils nacheinander eingesetzt und separat vermessen werden. Der Vorteil des Einstrahlphotometers besteht darin, dass nur eine Quarzküvette verwendet wird, was gleichbleibende Bedingungen für die verschiedenen Messungen ermöglicht. Das monochromatische Licht strahlt durch die Probe, wobei ein Teil des Lichts von der Probe absorbiert wird. Das restliche, von der Probe durchgelassene Licht (Transmission) kann mittels eines Detektors erfasst werden.

Das hier verwendete Photometer verfügt über eine Photodiode, welche die Intensität des durchgelassenen Lichtstrahls im gewünschten Wellenlängenbereich misst. ¹¹ Das aufgenommene Licht wird mithilfe eines Sekundärelektronenvervielfachers (Photomultiplier) in ein elektrisches Signal umgewandelt, indem die Photonen des durchgelassenen Lichts Elektronen aus der metallischen Oberfläche der Photokathode herauslösen. Die freigesetzten Elektronen werden in einem elektrischen Feld in Richtung der Anode beschleunigt, wobei sie auf Dynoden treffen. Dynoden stellen eine Anreihung von einzelnen Elektroden dar, die in Richtung der Anode zunehmend positiver werden. Aus ihnen werden weitere Elektronen herausgeschlagen, sodass man von einer Vervielfachung der Sekundärelektronen spricht. An der Anode lösen die Elektronen einen Spannungsabfall aus, der das Messsignal darstellt. Das zugrundeliegende Prinzip bezeichnet man als äußeren Photoeffekt.¹²

Das gemessene Signal kann mittels einer Software aufgezeichnet und somit veranschaulicht werden (EDV). Im Praktikum wird das Programm WinAspect genutzt.

Durchführung

Im ersten Schritt des Versuchs werden zwei Verdünnungsreihen hergestellt (siehe Abb. 5). Dafür wird zunächst eine Lösung a angesetzt, aus welcher dann die beiden Lösungen b und c hergestellt werden. Gegebenenfalls müssen davor die Salzsäure (0,1 mol/L) und der Phosphatpuffer (pH = 6,88) hergestellt werden. Durch das Herstellen der Verdünnungsreihen wird verhindert, dass es zu Fehlern durch zu hohe Ungenauigkeiten beim Pipettieren von kleinen Volumina kommt. Gleichzeitig bilden die Verdünnungsschritte selbst eine Fehlerquelle.

Herstellung Lösung a

Hierfür werden 50,0 mg der Probesubstanz genau auf einer Analysenwaage in einem Wägeschiffchen abgewogen und in einen 50,0 ml Messkolben überführt. Anschließend wird das Wägeschiffchen zurückgewogen, damit später genau bestimmt werden kann, welche Masse an Probesubstanz sich in der Lösung befindet. Der Messkolben wird nun mit Salzsäure-Lösung (0,1 mol/L) bis zur Eichmarke aufgefüllt und geschüttelt. Diese hergestellte Lösung ist die Grundlage zur Herstellung für die zur Vermessung verwendeten Lösungen b und c.

Herstellung Lösung b

Für die Herstellung von Lösung b1 werden aus der Lösung a mit einer Vollpipette 10,0 mL entnommen und in einen 100,0 mL Messkolben überführt. Dieser Messkolben wird mit Salzsäure (0,1 mol/L) aufgefüllt. Aus dem 100,0 ml Messkolben werden wieder 10,0 mL mit einer Vollpipette entnommen und in einen zweiten 100,0 mL Messkolben gegeben. Diese Lösung wird erneut mit Salzsäure (0,1 mol/L) verdünnt und so die Lösung b2 hergestellt. Die Lösung b2 ist die, welche zur Vermessung verwendet wird.

Herstellung Lösung c

Zur Herstellung von der Lösung c1 werden aus dem Messkolben von Lösung a 10,0 ml entnommen und in einen 100,0 ml Messkolben gegeben. Dieser wird mit einer Phosphatpuffer-Lösung (pH = 6,88) bis zur Eichmarke aufgefüllt und geschwenkt. Aus dieser Lösung c1 werden für die Herstellung von Lösung c2 wieder 10,0 ml entnommen, in einen neuen 100,0 ml Messkolben überführt und mit der gleichen Phosphatpuffer-Lösung aufgefüllt. Auch hier wird die hergestellte Lösung c2 vermessen.

Messungen der Absorptionen

Die Lösungen b2 und c2 vermessen. Dafür wird zunächst der Untergrund bestimmt, was für die Lösung b2 mit der Salzsäure (0,1 mol/L) erfolgt. Eine Quarzküvette wird dafür mehrere Male mit der Salzsäure durchgespült, damit sie innen von allen Seiten vollständig benetzt ist, dann zu 3/4 gefüllt und mit dem Deckel drauf in den Probenraum des Einstrahlphotometer gestellt. Beim Hineinstellen der Küvette in den Probenraum ist darauf zu achten, dass sie gerade steht und dass die Küvette immer von der gleichen Seite aus vermessen wird (z.B. immer mit der Schrift nach vorne zeigend). Zudem sollte die Quarzküvette nur oben an den matten Seiten angefasst werden, da es sonst zu einem Fettfilm oder Verunreinigungen auf den glatten Seiten, und somit zu Messfehlern kommen könnte. Mit einem Papiertuch kann die Quarzküvette von außen gesäubert werden. Die Messung wird am Computer nach der ausgelegten SOP gestartet. Es wird immer zuerst eine Referenz mit dem Lösungsmittel vermessen, da jedes Lösungsmittel eine Eigenabsorption aufweist. Diese muss dann von der Absorption der gemessenen Probelösung abgezogen werden, da es sonst zu einem verfälschten Ergebnis kommt. Dies wird von dem Gerät schon automatisch erledigt. Nachdem die Messung erfolgt ist, wird die erste Probelösung b2 vermessen. Die Quarzküvette wird erneut einige Male mit der Lösung b2 durchgespült, gefüllt, und in das Photometer gestellt. Insgesamt wird die Probelösung b2 drei Mal im Spektralbereich von 250 - 350 nm vermessen. Nach den drei Messungen wird dieser erste Messzyklus beendet und das Gerät zeigt die gemessenen Absorptionen in einem Graphen an. Durch Öffnung der Tabelle kann man das für Pyridoxin charakteristische Absorptionsmaximum zwischen 288 - 296 nm raussuchen und für die spätere Auswertung notieren. Für die Messung der Lösung c2 wird auch zuerst eine Untergrundmessung durchgeführt. Hierfür wird die Quarzküvette mit der Phosphatpuffer-Lösung (pH = 6,88) einige Male durchgespült und gefüllt. Die Messung erfolgt genauso, wie bei der Salzsäure oben beschrieben, hier aber im Spektralbereich von 220 - 350 nm. Nach erfolgter Durchführung kann die Lösung c2 nach demselben Prinzip wie Lösung b2 ebenfalls drei Mal vermessen werden. Hier werden im Spektralbereich von 248 - 256nm und 320 - 327nm die Absorptionsmaxima notiert.¹⁴

Auswertung

Mathematisch-physikalischer Hintergrund

Zur Auswertung werden die Absorptionen der zwei verdünnten Lösungen betrachtet. Die Absorption ist laut Arzneibuch definiert als der Logarithmus zur Basis 10 des reziproken Wertes der Transmission T von monochromatischer Strahlung. Die dimensionslose Größe wird ausgedrückt durch die Absorptions-Einheit AU ("absorbance units"¹⁵) und durch die Gleichung ⚠ $$ A = \log_{10} \left(\frac{1}{T}\right) = \log_{10} \left(\frac{I_{0}}{I}\right) mit \text{ } T = \displaystyle\frac{I}{I_{0}} ⚠ $$ definiert. ¹⁶ I stellt dabei die austretende Lichtintensität aus dem Medium dar, während I(0) die eintretende Lichtintensität ist. Dazu gilt das Lambert-Beer’sche-Gesetz, welches die Proportionalität der Absorption zur Konzentration c und Wegstrecke l der Strahlung durch die Probe ausdrückt: ⚠ $$ A =\varepsilon \cdot c \cdot l ⚠ $$

wobei:

ε = molarer Absorptionskoeffizient in L/(mol⋅cm)

c = molare Konzentration der Substanz in der Lösung in mol/L

l = Absorptionswegstrecke (Schichtdicke) in cm ¹⁷

Der molare Absorptionskoeffizient ε ist stoff- und wellenlängenspezifisch ¹⁸ und variiert bei verschiedenen pH-Werten ¹⁹, Lösemitteln ²⁰ und Temperaturen²¹.

In Monographien wird zur Identifizierung häufig die spezifische Absorption A(1%,1cm) einer Substanz angegeben, die sich auf eine Lösung von 1g Substanz in 100mL Lösemittel (entsprechend 1 Prozent m/V) in einer 1cm breiten Küvette und einer bestimmten Wellenlänge bezieht. Sie hängt folgendermaßen mit der Absorption zusammen: ⚠ $$ A = A_{1cm}^{1\%} \cdot c_{i} \cdot l ⚠ $$ wobei c(i) = Massekonzentration der Substanz in g/100mL. ²²

Des Weiteren stehen die spezifische Absorption A(1%,1cm) und die molare Absorption ε in folgender mathematischer Verbindung zueinander:

⚠ $$ A_{1cm}^{1\%} = \displaystyle\frac{10 \cdot \varepsilon}{M} ⚠ $$ wobei M = Molare Masse in g/mol. ²³

Berechnung der spezifischen Absorption

Auch in dem Versuch wird die spezifische Absorption A(1%,1cm) bei bestimmten Wellenlängen berechnet und als Hauptkriterium der Auswertung genutzt. Berechnet wird sie, indem das Lambert-Beer’sche-Gesetz nach ε umgestellt wird und die erhaltene molare Absorption in die Gleichung für die spezifische Absorption eingesetzt wird. Um die molare Absorption zu ermitteln, wird die größte gemessene Absorption A im Bereich von 288 bis 296nm für Lösung b sowie die größte Absorption in den Bereichen 248-256nm und 320-327nm für Lösung c eingesetzt.

Die Molare Masse von Pyridoxinhydrochlorid beträgt 205,6 g/mol, die Schichtdicke der Küvette in unserem Versuch 1cm. ²⁴

⚠ $$ A = \varepsilon \cdot c \cdot l \Leftrightarrow \varepsilon = \displaystyle\frac{A}{c \cdot l} ⚠ $$

⚠ $$ A_{1cm,Pyridoxin-HCl}^{1\%} = \displaystyle\frac{10 \cdot \varepsilon}{205,6 \frac{g}{mol}} ⚠ $$

Da beide Lösungen dreimal vermessen werden, ist am Ende jeweils der Mittelwert der erhaltenen spezifischen Absorptionen zu berechnen und dabei auf drei signifikante Stellen zu runden. Aus insgesamt neun berechneten Werten für A(1%,1cm) entstehen so drei Mittelwerte. Die Mittelwerte werden mit den Referenzwerten aus der Monographie für Pyridoxinhydrochlorid aus dem Arzneibuch, Prüfung auf Identität, Methode A verglichen:

Spezifische Absorptionen in den Absorptionsmaxima

Alle drei Werte für die spezifische Absorption müssen dabei im Toleranzbereich liegen. Liegt mindestens einer der Werte außerhalb der Toleranz, entspricht die Substanz nicht den Anforderungen. Wenn alle Werte in den entsprechenden Toleranzbereichen liegen, gilt die Substanz als identifiziert.

Berechnung der Konzentration

Die Konzentration der Messlösung wird bei der Berechnung des molaren Extinktionskoeffizienten ε benötigt. Sie wird anhand von der genauen Einwaage und Rückwaage ausgerechnet, wobei letzteres von der Einwaage abgezogen wird, um auf die reale, überführte Masse zurückzuschließen. Wie für alle Stoffmengen n wird der Term

⚠ $$ n = \displaystyle\frac{m}{M} ⚠ $$

mit der Masse m und molarer Masse M hierfür genutzt. Die Stoffmengenkonzentration c der Messlösung wird berechnet mit: ²⁶

⚠ $$ c = \displaystyle\frac{n}{V}\cdot f ⚠ $$

Wobei das Volumen V in diesem Fall 0,0500L, also 50,0mL beträgt.

Da für Lösung b2 und c2 zweimal je 10,0mL der Lösung a und b1 bzw. c1 auf 100,0mL aufgefüllt werden, sind für diese Lösungen der Verdünnungsfaktor f von

⚠ $$ f = \displaystyle\frac{10mL \cdot 10mL}{100mL \cdot 100mL} = 0,01 ⚠ $$

in der Rechnung zu berücksichtigen. ²⁷

Bei einer exakten Einwaage von 50,00mg ergibt sich nun für die Konzentration c beispielhaft:

⚠ $$ n_{Pyridoxin-HCl} = \displaystyle\frac{0,05000g}{205,6 \frac{g}{mol}} = 2,4319 \cdot 10^{-4} mol ⚠ $$

⚠ $$ c_{Pyridoxin-HCl} = \displaystyle\frac{2,4319 \cdot 10^{-4} mol}{0,0500L} \cdot 0,01 = 4,8638 \cdot 10^{-5} \frac{mol}{L} ⚠ $$

Bei der Berechnung ist es wichtig, stets die genauen Einwaagen, Messwerte und berechneten Werte in die Gleichungen einzusetzen, um falsche Ansagen durch Rundungsfehler zu vermeiden.

Einzelnachweise

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