Hochleistungsflüssigkeitschromatographie

Antwort A ist korrekt.

¹
A: Mehrwegeffekt (Eddy-Diffusion) - Analytmoleküle legen verschiedene Wege um die Partikel der stationären Phase zurück und dabei kann die Fließgeschwindigkeit diese Wege nicht beeinflussen.²

B: Längs-/Longitudinaldiffusion - Analytmoleküle können sich nicht immer in eine Fließrichtung bewegen, denn sie haben die Tendenz seitlich zu schwanken. Die Erhöhung der Flussrate vermindert diese Tendenz.³

C: Massenübergang - Beschreibt die Wechselwirkung der mobilen Phase mit der stationären Phase. Am Ende wird die Probenfront weitergezogen und dies bewirkt eine Peak-Verbreiterung.⁴

⁵

Antwort E ist korrekt
Das Fließmittel, welches in den Eluenten-Gefäßen enthalten ist, wird anhand des Pumpensystems in Richtung Trennsäule transportiert. Der Autosampler injiziert die Probe in den Fließmittelstrom und an der Trennsäule findet die chromatographische Trennung statt. Das aufgenommene Signal des Detektors wird computergestützt ausgewertet und wird als Chromatogramm dargestellt.⁷

Antwort D ist korrekt

Eine zu hohe Polarität bewirkt eine schnelle Elution, das Zusammenfließen verschiedener Stoffe und keine Basislinientrennung. ⁹

Antwort D ist korrekt
Elutionskraft: Kraft eines Lösungsmittels, Analytenmoleküle von der stationären Phase zu lösen und zum Detektor zu transportieren.
Begründung:
Bei steigender Polarität des Analyten nimmt durch die erhöhten Wechselwirkungen mit der stationäre Phase die Elutionskraft ab und umgekehrt. Die Reversed-Phase-Chromatographie dient der Trennung unpolarer Substanzen, d.h. man hat einen unpolaren Analyten und somit eine unpolare stationäre Phase. Der Einsatz eines unpolaren Lösungsmittels ist erforderlich, um den Analyten schnellstmöglich von der Säule zu lösen und zum Detektor zu transportieren.¹⁰

Antwort C ist korrekt

Begründung:
Die Aussagen 2) und 4) treffen auf die Gaschromatographie zu, jedoch nicht auf die HPLC.
1) Luftblasen können zu Druckschwankungen in der Pumpe führen und Geisterpeaks auslösen.
3) Eine stabile Basislinie ist essentiell für eine gute Auswertung des Chromatogramms.
5) Bei kleinen Partikeln hat man zum Beispiel viele Austauschprozesse in kürzerer Zeit.¹¹

Getrennt wird alles, was in Lösemittel gelöst werden kann, feste und flüssige Proben.
Vorteile gegenüber GC: Untersuchung von nichtflüchtigen und thermolabilen Substanzen möglich, da keine Temperaturbelastung vorhanden ist.¹².

Mögliche Trennmechanismen mit Substanzgruppen:

¹³

1) Größe des linearen Bereichs: In welchem Konzentrationsbereich besteht für den Detektor ein Zusammenhang zwischen der quantitativen Menge an Analyt und dem Detektorsignal?
2) Rauschen: Wie groß ist das Rauschen der Basislinie bei Anwendung des Detektors?
3) Drift: Kommt es bei der Anwendung des Detektors zu einem Drift der Basislinie, sodass sich die Basislinie verändert?
4) Gradiententauglichkeit: Wenn eine Gradientenelution angewendet wird, ist der Detektor überhaupt Gradienten-tauglich?
5) Selektivität: Wie selektiv ist der Detektor?
6) Empfindlichkeit: Wie groß ist die Empfindlichkeit?
7) LOD/LOQ: Wo liegt das Limit of Detection und das Limit of Quantification für diesen Detektor?¹⁴

Retentionszeit: Qualitative Aussage darüber, welche Stoffe in der Analysensubstanz enthalten sind.
Area unter den Peaks: Quantitative Aussage darüber, wie groß der jeweilige Anteil des Analyten ist.¹⁵

Der pH-Wert des Puffers muss möglichst zwei Einheiten vom pKs des Analyten entfernt sein, damit der Analyt einen definierten Ladungszustand hat und nicht in verschiedenen Ladungszuständen vorliegt. Ansonsten kommt es zu einer schlechten Trennung.¹⁶

1) Hoher Reinheitsgrad von Lösungsmitteln und Puffersalzen, keine Verunreinigungen
2.) Zur korrekten Herstellung: Exakte pH-Wert-Einstellung notwendig, beim Mischen verschiedener Lösungsmittel Volumen-Kontraktion möglich
3.) pH-Wert des Puffers möglichst zwei Einheiten vom pKs des Analyten entfernt, um sicherzustellen, dass es sich um einen definierten Ladungszustand des Analyten handelt
4.) Filtration: 0,45 oder 0,20 µm, um eventuell vorhandene Verunreinigungen zu entfernen, die in der Anlage zu einem Verschluss der sehr feinen Kapillaren führen können
5.) Entgasung, um Geisterpeaks zu vermeiden, Durchführung mit Ultraschall, Vakuum oder Helium¹⁷.

Ein pulsationsfreier Fluss ist eine Voraussetzung für eine stabile Basislinie, die essentiell für die Auswertung eines Chromatogramms ist. Dieser wird gewährleistet durch eine Kurzhub-Doppelkolben-Pumpe, die aus zwei Pumpen besteht, die abwechselnd pumpen. Somit pumpt die eine Pumpe in dem Intervall, indem die andere gerade den Austausch verschlossen hat. ¹⁹