Hochleistungsflüssigkeitschromatographie


Übung
Hochleistungsflüssigkeitschromatographie
SoSe 2022

Abgabedatum
20.06.2022

Expertengruppe 06
Nisa-Seyda Dilli
Mahgol Azimi
Songül Oral




Inhaltsverzeichnis

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Multiple Choice (MC) Fragen

Van-Deemter-Gleichung

Wie verhalten sich die Terme A, B und C der Van-Deemter-Gleichung, wenn die Fließgeschwindigkeit erhöht wird?

A. A ist unabhängig von der Fließgeschwindigkeit, B wird kleiner und C wird größer.
B. A wird größer, B ist unabhängig von der Fließgeschwindigkeit, C wird kleiner.
C. A ist unabhängig von der Fließgeschwindigkeit, B wird größer, C wird größer.
D. A wird größer, B ist unabhängig von der Fließgeschwindigkeit und C wird größer.
E. A ist unabhängig von der Fließgeschwindigkeit, B wird kleiner und C wird kleiner.

Antwort A ist korrekt.

1
A: Mehrwegeffekt (Eddy-Diffusion) - Analytmoleküle legen verschiedene Wege um die Partikel der stationären Phase zurück und dabei kann die Fließgeschwindigkeit diese Wege nicht beeinflussen.2

B: Längs-/Longitudinaldiffusion - Analytmoleküle können sich nicht immer in eine Fließrichtung bewegen, denn sie haben die Tendenz seitlich zu schwanken. Die Erhöhung der Flussrate vermindert diese Tendenz.3

C: Massenübergang - Beschreibt die Wechselwirkung der mobilen Phase mit der stationären Phase. Am Ende wird die Probenfront weitergezogen und dies bewirkt eine Peak-Verbreiterung.4

5

Aufbau einer HPLC-Anlage

Welche Reihenfolge trifft für den Aufbau einer HPLC- Anlage zu?

6

A. 1, 2, 5, 3, 4
B. 2, 4, 3, 1, 5
C. 5, 2, 4, 3, 1
D. 2, 4, 5, 1, 3
E. 1, 2, 5, 4, 3

Antwort E ist korrekt
Das Fließmittel, welches in den Eluenten-Gefäßen enthalten ist, wird anhand des Pumpensystems in Richtung Trennsäule transportiert. Der Autosampler injiziert die Probe in den Fließmittelstrom und an der Trennsäule findet die chromatographische Trennung statt. Das aufgenommene Signal des Detektors wird computergestützt ausgewertet und wird als Chromatogramm dargestellt.7

Retentionsverhalten

Welches der unten angezeigten Chromatogramme entspricht einem Chromatogramm der Normalphasen-Chromatographie mit zu hoher Polarität der mobilen Phase für den Analyten?

[Polarität der Probenbestandteile: A< B< C < D]

A.

B.

C.

D. 8

E. Keines der Chromatogramme.

Antwort D ist korrekt

Eine zu hohe Polarität bewirkt eine schnelle Elution, das Zusammenfließen verschiedener Stoffe und keine Basislinientrennung. 9

Chromatographische Parameter

Wie verhalten sich die Polarität und die Elutionskraft bei der eluotropen Reihe für die Reversed-Phase-Chromatographie?

A. Polarität ↑ Elutionskraft ↓
B. Polarität ↑ Elutionskraft ↑
C. Polarität ↓ Elutionskraft ↓
D. Polarität ↓ Elutionskraft ↑
E. Die Polarität und die Elutionskraft beeinflussen sich nicht gegenseitig.

A. Nur 1 ist richtig
B. Nur 2 ist richtig
C. Nur 2 und 3 sind richtig
D. Nur 1 und 4 sind richtig
E. Nur 5 ist richtig

Antwort D ist korrekt
Elutionskraft: Kraft eines Lösungsmittels, Analytenmoleküle von der stationären Phase zu lösen und zum Detektor zu transportieren.
Begründung:
Bei steigender Polarität des Analyten nimmt durch die erhöhten Wechselwirkungen mit der stationäre Phase die Elutionskraft ab und umgekehrt. Die Reversed-Phase-Chromatographie dient der Trennung unpolarer Substanzen, d.h. man hat einen unpolaren Analyten und somit eine unpolare stationäre Phase. Der Einsatz eines unpolaren Lösungsmittels ist erforderlich, um den Analyten schnellstmöglich von der Säule zu lösen und zum Detektor zu transportieren.10

Probe und Fließmittel

Welche der folgenden Aussagen treffen zu?

1) Das Fließmittel muss entgast werden, um Luftblasen zu eliminieren.
2) Der Analyt muss unzersetzt verdampfbar sein.
3) In der Pumpe muss ein pulsationsfreier Fluss herrschen, um eine stabile Basislinie zu erhalten.
4) Nach dem Probeneinlass muss der Analyt in die Gasphase überführt und folglich ionisiert werden.
5) Die Partikelgröße der stationären Phase ist entscheidend für die Qualität einer Säule.

A. Nur 1 ist richtig
B. 1, 2 und 3 sind richtig
C. 1, 3 und 5 sind richtig
D. 1, 2, 4 und 5 sind richtig
E. 1 bis 5 (alle)

Antwort C ist korrekt

Begründung:
Die Aussagen 2) und 4) treffen auf die Gaschromatographie zu, jedoch nicht auf die HPLC.
1) Luftblasen können zu Druckschwankungen in der Pumpe führen und Geisterpeaks auslösen.
3) Eine stabile Basislinie ist essentiell für eine gute Auswertung des Chromatogramms.
5) Bei kleinen Partikeln hat man zum Beispiel viele Austauschprozesse in kürzerer Zeit.11

Textaufgaben

Trennmethoden und Geräteaufbau

  1. Welche Art von Proben können mittels HPLC getrennt werden und welche Vorteile ergeben sich daraus gegenüber der GC?

Getrennt wird alles, was in Lösemittel gelöst werden kann, feste und flüssige Proben.
Vorteile gegenüber GC: Untersuchung von nichtflüchtigen und thermolabilen Substanzen möglich, da keine Temperaturbelastung vorhanden ist.12.

  1. Nennen Sie drei Trennmechanismen der HPLC und die jeweils dazu passende Substanzgruppe, die damit getrennt werden kann.

Mögliche Trennmechanismen mit Substanzgruppen:

  1. Durch welche Kriterien entscheidet man, welcher Detektor für die entsprechende analytische Anwendung besonders geeignet ist?

1) Größe des linearen Bereichs: In welchem Konzentrationsbereich besteht für den Detektor ein Zusammenhang zwischen der quantitativen Menge an Analyt und dem Detektorsignal?
2) Rauschen: Wie groß ist das Rauschen der Basislinie bei Anwendung des Detektors?
3) Drift: Kommt es bei der Anwendung des Detektors zu einem Drift der Basislinie, sodass sich die Basislinie verändert?
4) Gradiententauglichkeit: Wenn eine Gradientenelution angewendet wird, ist der Detektor überhaupt Gradienten-tauglich?
5) Selektivität: Wie selektiv ist der Detektor?
6) Empfindlichkeit: Wie groß ist die Empfindlichkeit?
7) LOD/LOQ: Wo liegt das Limit of Detection und das Limit of Quantification für diesen Detektor?14

  1. Anhand eines Chromatogramms werden die Retentionszeiten und die Areas unter den Peaks bestimmt. Was ist der analytische Zweck dieser beiden Werte?

Retentionszeit: Qualitative Aussage darüber, welche Stoffe in der Analysensubstanz enthalten sind.
Area unter den Peaks: Quantitative Aussage darüber, wie groß der jeweilige Anteil des Analyten ist.15

Anforderungen an die HPLC

  1. Warum muss der pH-Wert des Puffers möglichst zwei Einheiten vom pKs des Analyten entfernt sein?

Der pH-Wert des Puffers muss möglichst zwei Einheiten vom pKs des Analyten entfernt sein, damit der Analyt einen definierten Ladungszustand hat und nicht in verschiedenen Ladungszuständen vorliegt. Ansonsten kommt es zu einer schlechten Trennung.16

  1. Nennen Sie drei Anforderungen an das Fließmittel.

1) Hoher Reinheitsgrad von Lösungsmitteln und Puffersalzen, keine Verunreinigungen
2.) Zur korrekten Herstellung: Exakte pH-Wert-Einstellung notwendig, beim Mischen verschiedener Lösungsmittel Volumen-Kontraktion möglich
3.) pH-Wert des Puffers möglichst zwei Einheiten vom pKs des Analyten entfernt, um sicherzustellen, dass es sich um einen definierten Ladungszustand des Analyten handelt
4.) Filtration: 0,45 oder 0,20 µm, um eventuell vorhandene Verunreinigungen zu entfernen, die in der Anlage zu einem Verschluss der sehr feinen Kapillaren führen können
5.) Entgasung, um Geisterpeaks zu vermeiden, Durchführung mit Ultraschall, Vakuum oder Helium17.

  1. Welche zwei Elutionsarten gibt es? Erklären Sie inwiefern sich diese beiden voneinander unterscheiden.

  1. Warum ist ein pulsationsfreier Fluss wichtig und wie kann dieser gewährleistet werden?

Ein pulsationsfreier Fluss ist eine Voraussetzung für eine stabile Basislinie, die essentiell für die Auswertung eines Chromatogramms ist. Dieser wird gewährleistet durch eine Kurzhub-Doppelkolben-Pumpe, die aus zwei Pumpen besteht, die abwechselnd pumpen. Somit pumpt die eine Pumpe in dem Intervall, indem die andere gerade den Austausch verschlossen hat. 19

Einzelnachweise

1 Gleichung erstellt von Mahgol Azimi

2 vgl.Skript: Hochleistungs-Flüssigchromatographie, Sebastian Bendas, Nadine Francke Folie 21

3 vgl.Skript: Hochleistungs-Flüssigchromatographie, Sebastian Bendas, Nadine Francke Folie 22

4 vgl.Skript: Hochleistungs-Flüssigchromatographie, Sebastian Bendas, Nadine Francke Folie 23

5 Abbildung erstellt von Mahgol Azimi, in Anlehnung an das Skript: Hochleistungs-Flüssigchromatographie, Sebastian Bendas, Nadine Francke Folie 24

6 Abbildungen erstellt von Mahgol Azimi. in Anlehnung an das Skript: Hochleistungs-Flüssigchromatographie, Sebastian Bendas, Nadine Francke Folie 26

7 vgl.Skript: Hochleistungs-Flüssigchromatographie, Sebastian Bendas, Nadine Francke Folie 26

8 Abbildungen erstellt von Mahgol Azimi, in Anlehnung an das Skript: Hochleistungs-Flüssigchromatographie, Sebastian Bendas, Nadine Francke Folie 54

9 vgl.Skript: Hochleistungs-Flüssigchromatographie, Sebastian Bendas, Nadine Francke Folie 54

10 vgl.Skript: Hochleistungs-Flüssigchromatographie, Sebastian Bendas, Nadine Francke Folie 57

11 vgl. Skript: High Performance Liquid Chromatography (HPLC), Hermann Wätzig/Sami Eldeeb Folie 13 und vgl.Skript: Hochleistungs-Flüssigchromatographie, Sebastian Bendas, Nadine Francke Folie 29

12 vgl.Skript: Hochleistungs-Flüssigchromatographie, Sebastian Bendas, Nadine Francke Folie 40

13 Tabelle erstellt von Mahgol Azimi, in Anlehnung an das Skript: Hochleistungs-Flüssigchromatographie, Sebastian Bendas, Nadine Francke Folie 51

14 vgl.Skript: Hochleistungs-Flüssigchromatographie, Sebastian Bendas, Nadine Francke Folie 46

15 vgl.Skript: Hochleistungs-Flüssigchromatographie, Sebastian Bendas, Nadine Francke Folie 9

16 vgl.Skript: Hochleistungs-Flüssigchromatographie, Sebastian Bendas, Nadine Francke Folie 29

17 vgl.Skript: Hochleistungs-Flüssigchromatographie, Sebastian Bendas, Nadine Francke Folie 29

18 Tabelle erstellt von Mahgol Azimi, in Anlehnung an das Skript: Hochleistungs-Flüssigchromatographie, Sebastian Bendas, Nadine Francke Folie 35

19 vgl.Skript: Hochleistungs-Flüssigchromatographie, Sebastian Bendas, Nadine Francke Folie 32 und 34